De Mona Lisa is het portret van een jonge vrouw met op de achtergrond een berglandschap. Ze zit op een loggia, gesuggereerd door het muurtje achter haar en de fragmentarische kolommen in de beeldrand, in een stoel waarvan de armleuning parallel aan het beeldvlak loopt en als het ware een afsluiting vormt tussen het model en de waarnemer. Haar torso staat schuin ten opzichte van het beeldvlak, maar haar gezicht is naar het beeldvlak gekeerd en ze kijkt de waarnemer aan.

Ze draagt donkere kleding en over het haar een doorzichtige zwarte sluier. Die sluier werd dikwijls gezien als een symbool van rouw, maar anderen zeggen dat een dergelijke sluier ook gezien kan worden als een symbool van deugdzaamheid. Haar handen liggen gekruist op de leuning van de armstoel en ze lijkt klaar om een kindje in haar armen te dragen. De dame heeft geen wenkbrauwen of wimpers, maar in 2007 kon Pascal Cotte uit hogeresolutiescans afleiden dat wenkbrauwen en wimpers origineel aanwezig waren maar mettertijd waren uitgewist, misschien bij vroegere restauraties van het schilderij.

De kopie die bijna gelijktijdig werd gemaakt en die bewaard wordt in het Prado in Madrid heeft wel wenkbrauwen. Opmerkelijk aan het schilderij is ook de breuk in de horizonlijn van de achtergrond.